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上海世纪助孕怎么样_世纪助孕骗局_麻腮风第八天发烧定律是什么意思?
来源:http://www.zixun.net.cn  日期:2022-09-05
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麻腮风第八天发烧定律的意思是很多宝宝在接种完麻腮风疫苗后的第八天都会出现发烧的反应,由于发烧的宝宝比较多且有规律性,因此很多宝妈们将这个反应定义为麻腮风第八天发烧定律。但实际上这个定律并不准,也没有科学依据,纵然有部分宝宝在接种后的第8天出现了发烧反应,也无法确保该定律的准确性和真实性,所以也不是一定就会发生。

宝宝接种麻腮风疫苗后的八天定律实际上是接种麻腮风疫苗的常见反应,但由于是发烧,因此家长也一定要做好对宝宝身体状况的监测。在接种完麻腮风疫苗后注意以下几点可以避免麻腮风疫苗的不良反应对宝宝造成更大的伤害:

1.在接种后的24-48小时内应尽量避免洗澡,同时要保证接种部位的干燥和整洁,避免局部感染;

2.麻腮风疫苗后引起的发热一般不会很高,通常不会超过38.5℃,而且持续时间比较短,可能在1-2天之内消退,发烧后视宝宝的情况对症处理,若是低热可以采取物理方式降温,高烧时可以适当给孩子服用退烧药,但若是高烧一直不退或是忽高忽低则需要尽快就医;

3.观察宝宝接种部位是否出现红肿和疼痛的现象,若出现感染需要及时就医;

4.麻腮风第八天定律除了发烧还可能起疹子,家长一定要注意宝宝的日常护理,多进行水分的补充,特别是发烧后,一定要避免剧烈活动,注意保暖。

“不说这个,太痛苦了”。


像赵丽(化名)一样,很多通过试管婴儿技术成功诞下孩子的母亲很少向别人提及自己的经历,这是小部分人的隐痛。但实际上,需要借助人工干预手段进行生育的人群已经不是小众群体,多家上市公司招股书引用的数据显示,中国不孕不育患者人数超过5000万。

而辅助生殖技术已经在临床上运用多年。其中,试管婴儿技术又被称为众多不孕夫妇的“最后一道希望”。

在我国,每年约有30万名试管婴儿诞生,每一个试管婴儿的背后,是精力和金钱的付出。根据《中国高龄不孕女性辅助生殖临床实践指南》测算,女性在35岁及以下时,平均需要3个治疗周期成功活产,单次取卵周期价格约3.3万元-4.2万元。这意味着育龄女性成功活产一次至少需要花费10万元,甚至更多。

随着一系列鼓励生育政策的出台,辅助生殖的价格显然不应成为限制生育的理由。近日,人工授精术、胚胎移植术等16项辅助生殖技术项目被率先纳入北京医保甲类目录,3月26日正式实施后,北京“求娃”群体平均可以减少1万元的诊疗费用。

患者欣慰,市场鼓舞。政策公布当天,锦欣生殖(01951.HK)、达嘉维康(301126.SZ)等相关公司股价大涨。但总体费用较高、诊疗位置相对靠后、专业牌照稀缺仍是辅助生殖技术惠及不育不孕人群的三大阻碍。首次纳入医保堪称“破冰”,有业内人士直言,但比起蛋糕怎么分配的问题,现阶段思考怎么把蛋糕做大更加重要。

三次移植后终于成功:

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不会主动说孩子是试管婴儿

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2020年春节,赵丽(化名)是在医院产房里度过的。为了这一刻,41岁的赵丽已经努力了5年。听到孩子响亮的啼哭声,赵丽也哭了,泪水一半是喜悦,一半是多年来的辛酸和努力积压后的如释重负。

虽然亲友都知道这个孩子是以试管婴儿的方式出生,但鲜有人会提起这一话题。在孩子的满月宴上,有好奇的人打听赵丽做试管的经历,赵丽也是摆摆手,“不说这个,太痛苦了”。

“我不会主动说孩子是试管生下来的。虽然现在知道这个技术的人越来越多,我自己也是试管婴儿技术的受益者。但说不清楚是什么原因,可能一方面担心人家对孩子戴有色眼镜,一方面也是怕难免有人背后臆测我们夫妇有什么问题才不能生孩子。”赵丽说。

实际上,需要借助人工干预手段进行生育的人群已经不是小众群体。环境污染、生育年龄推迟、生活压力、不良生活习惯等多重因素还在推动这一数字持续增长。

为了满足不孕人群的生育需求,药物治疗、手术治疗和辅助生殖治疗都已在临床实践上进行多年。相对前两种方法,辅助生殖具有更高的妊娠率,其中试管婴儿技术又被称为众多不孕夫妇的“最后一道希望”。

北京大学乔杰院士团队的最新全国生殖健康流行病学调查分析结果显示,在我国,每年约有30万名试管婴儿诞生,辅助生殖治疗各项技术类别总周期数已超过100万周期/年。

不孕不育患者治疗方法图谱 数据来源:开源证券、九方金融研究院

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但试管婴儿技术同样是痛苦和风险并存。

在选择做试管以前,赵丽和丈夫尝试过民间土方、中医食疗、改善生活方式,但都无济于事。到医院进行了系统检查后,得到的结论是只能尝试试管婴儿。一开始医生为赵丽选定的是二代(卵细胞浆内单精子注射,ICSI)技术,但两次尝试后都着床失败,医生建议赵丽改做三代试管。

“那段时间都快绝望了。试管说起来简单,步骤画出来也就是一张图,但只有开始了才知道有多难。”赵丽说,“做试管之前我还担心需要打多少针、取卵有没有风险、移植安不安全,后来只关心一个问题,就是胚胎能不能着床”。

在第一次胚胎移植着床失败后,赵丽开始打黄体酮提高着床率,“每次要打五十到八十针,最开始我还数着扎针的次数,倒数什么时候能结束。后来就麻木了,屁股和肚子上都是针眼,扎针太多导致屁股上都是硬块。最疼的时候坐不能坐、躺也不能躺”。

身体上的折磨还是其次,更考验人的是失败带来的挫折和无力感,赵丽说,等待结果的两周堪称人生中最漫长的14天,最可怕的是不知道要经历多少个这样的14天。怀着尝试最后一次的想法,赵丽和丈夫专程赶到了北京一家在试管婴儿方面颇有声望的医院。在医院大厅里,赵丽见到了众多从各地赶来的有着同样困扰的患者。

为了省钱,赵丽住在离医院两公里远的一处家庭旅馆内,没想到,在这家旅馆内暂住的竟然都是和他们一样的求子夫妇。旅馆老板说,因为这家医院,养活了附近几公里以内近百家家庭旅馆。

此后的几个月里,赵丽在老家和北京之间往返,动车票攒了一沓,最终换来了一张显示着小生命的B超图。现在,赵丽的微信头像和朋友圈全是孩子的照片和视频。今年春节,赵丽让孩子录了一段视频,视频里,孩子已经可以咿咿呀呀地说着“新年快乐”。

“看到孩子的时候觉得一切都值了,但是让我回忆那段做试管的日子,还是有些难受。”赵丽说。

“不可能”变“可能”:

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辅助生殖技术完成医保“破冰”

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对于赵丽而言,辅助生殖点燃的是孕育的希望。而和赵丽一样的人群,点燃的则是一条千亿的辅助生殖赛道。

根据辅助生殖期刊《Reproductive Biology and Endocrinology》的数据,全球有约20%的不孕不育夫妇选择辅助生殖服务,创造了4341亿元的市场需求规模。从构成来看,试管婴儿占比97%,规模为4212亿元,成为辅助生殖市场的主导需求。

国内ATR服务总周期数

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数据来源

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:太平洋证券

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在这一领域,已经有多家上市公司布局,如布局上游药物的丽珠集团、高值耗材的贝康医疗,布局下游机构的锦欣生殖、达嘉维康、康芝药业(300086.SZ)等等。

嗅觉灵敏的资本也早已瞄准辅助生殖赛道。2015年左右,红杉资本、华平投资、奥博资本、高瓴资本等老牌投资公司纷纷入局。2021年,又有觉资投资、金晟资本等30家投资机构下场。相关数据显示,去年初至11月,中国辅助生殖行业投融资规模超36亿元,至少有9家公司先后获得融资或被收购。

2022年伊始,一则消息又点燃了辅助生殖市场的情绪。2月21日,北京市医保局、卫健委、人社局发布《关于规范调整部分医疗服务价格项目的通知》,对体外受精胚胎培养等53项辅助生殖技术项目进行了统一定价,并将其中16个项目纳入甲类医保(仅限门诊),自3月26日起执行,适用于北京市15家基本医疗保险定点的公立辅助生殖医疗机构。

记者了解到,这一政策基本涵盖了北京市公立医疗机构开展辅助生殖的常用技术,被纳入甲类医保的16项辅助生殖技术覆盖了约8000-10000元的治疗费用(不包括三代技术),以单周期治疗费用约 35000-45000 元(不包括三代技术)为技术依据,按中位数计算,医保报销费用约占单周期治疗费用的23%左右。华创证券的数据也显示,此次被纳入北京医保的项目中,针对一代技术和二代技术降价约为1万左右,若后续细则跟进顺利,则每个IVF(试管婴儿一代技术)周期可降价25%-30%。

消息发布当日,辅助生殖概念股纷纷大涨。锦欣生殖招股书显示,截至2018年9月30日数据,每个IVF治取卵周期的平均花费为48279元。每例试管婴儿花费将近5万元。市场给予积极回应的重要原因之一,在于高价一直是我国辅助生殖渗透率在低位徘徊的重要因素。根据《中国高龄不孕女性辅助生殖临床实践指南》测算,女性在35岁及以下时,平均需要3个治疗周期成功活产,单次取卵周期价格约3.3万元-4.2万元,35岁以上的女性则需要更长周期。这意味着育龄女性成功活产一次至少需要花费10万元,甚至更多。

这些费用30%~40%流向药费,40%~50%流向手术费,10%~20%流向检查费,贯穿在促排卵、取卵、体外受精、胚胎移植、妊娠化验的各个环节,最终目的是在技术帮助下促成卵子和精子的艰难“约会”。一般来说,在耗时2到3个月的一个治疗周期中,患者的门诊次数约20次,吃药、打针、跑医院,每一项都要付出巨大的资金和时间成本。

业界普遍认为,将辅助生殖服务纳入医保有利于提高患者对价格的承受能力,进而打开渗透率“天花板”。从国外数据看,2016年日本试管婴儿在新生人口中占比5.54%,澳大利亚试管婴儿在新生人口中占比4.37%,其背后推动力量均来自于国家补助计划或高比例报销。例如,捷克、法国和瑞典为适龄妇女限定次数周期内的IVF及IUI(宫腔内人工授精)治疗提供100%的报销。

而据太平洋证券研报显示,2016年国内IVF渗透率为10.2%,远低于日本同期56.1%的水平,随着患者年龄结构变化、患者支付能提升和患者意识提升,预计2030年IVF渗透率有望提升至27%。

但是,也有声音指出,作为辅助生殖被纳入医保目录较为早期的尝试,本次相关技术入保力度相对有限。根据开源证券,将《通知》中的数据与北京某公立三甲医院公开披露的相关医疗服务价格目录对比,两个目录共有25项相同的辅助生殖技术项目,其中21项价格可比,7项价格上升、14项价格下降,提价项目变动幅度为7%~80%,降价项目变动幅度为1%~49%,提价项目的价格变动幅度更大;整体来看,21个可比项目加总价格变动幅度为-4%,整体变化不大。

北京某公立三甲医院价格目录和此次调价目录对比 数据来源:开源证券

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而在从业者看来,医疗机构短期内主动降价的可能性也不大。刘洁(化名)是一位在生殖医学领域耕耘近20年的医生,她告诉记者,目前用于试管婴儿的很多药物都是进口的,在总费用中也是一个大头,但目前进入北京医保甲类目录的16项费用,基本都是(手术)治疗的费用。

辅助生殖相关药物价格 数据来源:华尔街学堂

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上海世纪助孕正规机构

在一家私立辅助生殖医院从事管理工作的李铭(化名)也告诉记者,试管婴儿治疗的开销不仅发生在手术室环节,用药和体检也占了很大的比重。列入甲类目录的16项技术并非适用于所有患者,例如“胚胎移植前筛查”,只有具有家族遗传病,各项指标符合指征的患者才可以做。

“看起来好像这十几项加起来钱还挺多的,但是具体到人头,我们大概预评估了一下,可能能报销的大概1万出头。”李明说,如果患者全年门诊不再看其他病,门诊看病(报销)的额度是2万元,他这些总的费用大概是1万多能用到的。还有一部分需要自费30%。

辅助生殖机构接棒产科?

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先翻过费用这座山

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刘洁告诉记者,很多年前,试管婴儿还是一个相对陌生的词语,但随着社会经济水平的普遍提高,患者对试管婴儿的知晓度大大提升。目前,在她接诊的不孕不育患者中,有大概20%需要走到试管婴儿这一步。

目前,刘洁所在的公立医院还没有开展试管婴儿技术的资质,对于辅助生殖技术加快步伐挺进医保的观点,刘洁持积极态度,认为这是鼓励生育的配套工具。

“产妇数量这两年下降很明显。”刘洁说,2016年二胎政策出台后,自己医院的产妇数量出现了高峰,但到第二年开始慢慢滑坡,等到2018年就已经恢复到2015年的水平,此后便逐年递减。

与此同时,产妇的年龄分布开始“两头走”,即早孕和晚育的产妇数量逐渐增多,适龄产妇的数量减少。这一趋势或将继续推高不孕不育率——国家卫健委去年11月印发的《不孕不育防治健康教育核心信息》显示,年龄是影响生育能力的关键因素。女性在30岁后生育能力呈下降趋势,35岁以后生育能力迅速下降;男性40岁以后生育能力开始下降。

2019年,刘洁所在医院砍掉一个产科,如今的分娩量只有原来的一半。前几年疯狂扩张的私立产科医院开始寻求转型。

辅助生殖机构却接棒开跑。2016年至2019年,全国经批准开展人类辅助生殖技术的医疗机构从451家增加到517家,经批准设置人类精子库的医疗机构从23家增加到27家,其中不乏私立医院的身影,也孕育出锦欣生殖等一众热门上市公司。

不孕不育患者的选择变多,而他们最为关心的“成功率”即是这些机构最核心的竞争力。李铭告诉记者,常规来讲,公立三甲医院是患者确诊后的首选,等到做失败了再到私立机构,所以私立机构接收患者的平均年龄要比三甲医院的更高,但成功率不取决于医院的私立或公立性质,更重要的是医生技术、实验室设备、胚胎师经验等,有些私立机构的体验感或团队的稳定性可能要优于公立医院。

因此,即使私立机构试管婴儿的全套费用比公立医院高出近30%,仍然有很多患者奔着不用排队,就医环境私密和宣传中更高的成功率去私立医院就医。近年来,越来越多的辅助生殖医院在当地站稳脚跟,开始与私立妇科医院合作,或者自主开展产检、安胎、生产业务,从而为试管婴儿成功的怀孕准宝妈提供“一条龙服务”。

当各种生育鼓励政策频繁出台,辅助生殖概念开始起飞。最为典型的就是去年5月末三孩政策官宣和本次多项辅助生殖技术被列入北京医保后,辅助生殖上下游公司的股价飞涨。不过随后也迎来了持续降温。

值得一提的是,相比二级市场的狂热,一级市场则要“冷静”得多。

与同行交流后,刘洁也发现附近生殖中心的试管婴儿周期数没有达到市场预料的猛增,甚至有时还偏低。

对于这种落差,刘洁认为是生育欲望下降和不孕不育率攀升两种力量综合的结果。她举例称,假设原来10个适龄生育人群中有1个不孕不育患者,在熬夜等不良生活习惯普及后,不孕不育患者人数可能增加到1.5~2个,但与此同时,有生育意向的人数也在下降。两种因素影响下的试管婴儿需求人数,未必会显著增长甚至增长。

医疗投资人王蔷(化名)对《每日经济新闻》记者表示,辅助生殖行业是一个强政策属性行业,与政策态度、力度都密切相关。“可以看到‘二孩政策’等鼓励生育政策出台时,不管是行业还是资本都掀起了一阵不小的热度。因为大家明确看到政策是持鼓励态度的,所以都对市场规模寄予厚望。但这种热情往往是间歇性的,一些已上市标的股价表现平平,则是因为政策的力度还不够大,服务价格、牌照发放都限制了市场的体量,而资本是希望变现的”。

王蔷看来,北京率先将16项辅助生殖技术纳入医保释放了国家鼓励生育的信号,但在实操过程中还需要进一步观察效果和铺开的可行性。“医保的定位还是‘保基本’,各地的医保资金情况也不尽相同,辅助生殖纳入医保的范围和程度还有待商榷”。

有媒体报道,就在北京市医保局发布医保新政次日,上海市医保局便召开调研会,讨论关于将辅助生殖技术项目纳入医保等相关问题。但事实上,除经济发达地区外,还有不少地方的医保资金存在相当压力,将不菲的辅助生殖服务纳入医保显然有相当难度。此前,如河南省医保局曾在人民网领导留言板上回复道:当前河南还没有能力将医保支付范围扩大到辅助生殖,还只着重满足基本医疗需求;河南省医保局医保基金只是“略有盈余”。

“辅助生殖存在的异地求诊现象较突出,一线城市及医疗机构外地患者比例较高,而目前国内异地就医门诊费用直接结算还在试点推进当中,单个或少部分城市率先将辅助生殖纳入医保不会直接导致行业在短时间内快速增长。”王蔷补充到。

把蛋糕做大更重要

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头部医院供不应求、二三线机构“吃不饱”

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另一方面,在业内人士看来,服务价格只是限制辅助生殖行业起飞的因素之一。

卫健委数据显示,截至2020年12月31日,我国经批准开展人类辅助生殖技术的医疗机构共536家,其中获准开展一代、二代技术的医疗机构共411家;获准开展三代技术的医疗机构共78家。

而按照2021年1月发布的《人类辅助生殖技术应用规划(2021-2025年)》,要求提供“夫精人工授精技术、供精人工授精、体外受精-胚孩移植、卵胞浆内单精子显微注射技术”的辅助生殖机构在2021-2025年增设数量不得超过截至2020年底机构总数的15%,且按常住人口数测算原则上每230万-300万人口可设置1个辅助生殖机构;而人类精子库设置每省(区、市)原则上不超过1个。

这意味着,到2025年前,我国新增的辅助生殖机构不得超过80家。要成为幸运的八十分之一,也需要先跨过牌照审批的门槛。天风证券相关研报曾指出,辅助生殖牌照申请条件严、周期长,要集齐人工授精、试管婴儿一、二、三代牌照共需要约10.5年。

而在2021年2月,国家卫健委答复《关于增加辅助生殖技术机构数量,放宽辅助生殖技术准入的建议》时,曾明确表示“近年来,随着育龄妇女人数不断下降,全国辅助生殖技术服务量基本平稳,部分地区服务量呈现下降趋势,从供需情况看,国家卫健委认为现有辅助生殖机构已基本能够满足群众生殖健康服务需求”。

牌照稀缺使服务提供商难以通过自设连锁机构实现快速扩张。近年来,不管是行业新进者还是资深参与者,多是通过收购切入赛道或扩大规模。“但现实问题在于,国内9成的辅助生殖机构都是公立医院的生殖科,这些科室或医院不是民营机构想并购就能并购的。”王蔷表示。

拿到牌照也不代表患者就会蜂拥而来。壹加健康负责人许万鹏曾从事过多年的海外辅助生殖业务,他在接受记者采访时说,从数据上来看,目前国内的机构数量与市场需求是平衡的,但实际情况却是“供不应求”。他所说的“供不应求”,是指大量患者资源涌向头部医院和机构,而二三线机构却面临周期数不足的失衡。

“北医三院生殖医学中心每年的门诊量是几十万人,而在如广东中山、惠州等一些非中心城市的非头部医院的生殖科,一年只能做几百个。加之辅助生殖行业的特殊性——做的周期数越多,熟练度提升,成功率就越高,对患者人群的吸引力越强,周期数不足的机构成功率较低,口碑下滑,患者数量进一步减少。造成了头部医院需求性确定,新建或非头部机构很难分流。”许万鹏说。

在业内人士看来,目前还不是思考蛋糕如何分配的时候,“如何把蛋糕做大”是摆在眼前的问题。许万鹏认为,纳入医保是一剂强心针,但并非万灵药。他认为,辅助生殖市场的需求有扩大趋势,但这是阶段性的,预计持续时间应该在5-8年的时间左右。

辅助生殖行业与其他行业比净利率高 数据来源:开源证券、九方金融研究院

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他进一步表示,现在的市场增量大部分是 70后和80后,国家鼓励政策如医保开始后,这部分过去想生但是没能生的群体现在会有生育计划,由于年纪和身体的原因又需要借助辅助生殖的技术,但是再过5-8年,这一群增量基本消耗完毕,后续的增量在哪里,目前还没有看到。国内的辅助生育市场短期爆发后,会居于一个中等偏下的稳定市场水平。

有数据显示,2017-2020年,试管婴儿治疗占不孕不育夫妇比例分别为1.03%、1.19%、1.21%和1.36%。也就是说试管婴儿的渗透率并不高,提升的速度每年不到0.2个百分点 。造成此等结果的一个重要原因是:试管婴儿仍然属于不孕不育的“末线治疗”。无论是从患者心智还是成本来看,试管婴儿技术是最后一道“绝招”,但不到关键时刻不用。

国家卫健委也曾公开发声,表示“目前学者较为公认的我国不孕不育合并患病率为7%-10%。不孕不育的治疗手段是多样的,通过生活方式改变、心理治疗、药物、手术治疗等可以使多数患者获得成功妊娠,仅有不到20%的患者需要接受辅助生殖技术治疗”。

疫情开始后,许万鹏已经转行,他曾经的同行中除了一两家“幸运”地拿到了融资和牌照,转身在国内开起了民营辅助生殖机构,其他的也都悉数转行。“过去很多人是因为不想让人知道在做试管,所以选择去国外进行。现在国内辅助生殖的技术已经很成熟了,但比起改变生育条件,提高生育意愿的需求或许更强烈”。

记者手

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记丨价格只是辅助生殖的一座“大山”

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有需求的地方就有市场,对于辅助生殖来说也是如此。庞大的不孕不育群体倒逼了辅助生殖技术的进步,也孕育了价值千亿的辅助生殖市场。随着鼓励生育政策出台,尤其是北京率先将16项辅助生殖技术纳入医保,不少从业者为之欢欣鼓舞。

一旦纳入医保的服务范围扩大,或将辅助生殖纳入医保的地方增多,一直以来被认为困扰辅助生殖的“高价”问题或将迎来解决之道,也有利于降低需求人群的医疗负担。但另一方面,辅助生殖不属于“保基本”范畴,各地医保资金情况也不尽相同,难以将辅助生殖服务一揽子纳入。

不能忽视的是,除了价格外,生育意愿、规模可复制性以及消费者心智,都是辅助生殖要“爆发”前需要度过的前夜。

原标题:人工授精等辅助生殖项目首次纳入医保,平均可省万元!业内人士:堪称“破冰”

来源:每日经济新闻



ELISA样本制备指南及注意事项

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定义及介绍

ELISA(enzyme linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附测定)是最基础的免疫学实验之一,其理论基础是抗原抗体的特异性反应。ELISA因其特异性强、灵敏度高、稳定性好而被广泛使用。ELISA试剂盒检测样品包括血清、血浆、细胞培养上清、灌洗液或尿液等生物样本,实验操作步骤并不繁琐,但实验完成后需要把样本检测结果OD值转化为浓度值,从而供下一步分析所用,因此样品的预处理对于后续数据处理和结果分析非常重要。



样本制备指南


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血清

全血样品于室温放置2小时或2-8℃过夜后于2-8℃,1000×g离心20min,取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。避免使用溶血,高血脂样品

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2.血浆

抗凝剂推荐使用EDTA-Na

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,样品采集后30min内于2-8℃,1000×g离心15min,取上清即可检测。

3组织匀浆/组织全蛋白

用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液,称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃,5000×g离心5-10min,取上清检测。

其余方法:在分析天平(AL204型)上,称量50-100mg组织样本。在样本中加入5倍质量体积的含1%PMSF的1×PBS缓冲液;并用小剪刀等工具将组织样本剪碎(尽可能小块)。注:1×PBS缓冲液使用前,需加入PMSF,现用现加,PMSF终浓度为1mM。打开超声破碎仪,将超声破碎仪的功率调至25%,超声时间2s,间隔时间5s,总时间2min。放入样本,冰上超声3min。视样本匀浆情况调整总时长。超声完成后,将样本放于4℃或冰上裂解30min。打开离心机,将转速调至12000×g;将样本放入离心机,离心10min,取上清,按需要分装,于-20℃贮存。注:留取20μL样本,用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

组织匀浆液或组织全蛋白中的蛋白浓度对于检测实验的影响至关重要,建议样本蛋白浓度至少1mg/mL以上,较低浓度蛋白的组织匀浆液有可能导致ELISA检测失败。


4.细胞提取液

贴壁细胞

用冷的PBS轻轻清洗,然后用胰蛋白酶消化,1000×g离心5min后收集细胞;

悬浮细胞

可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每10

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个细胞中加入150-200μLPBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂;若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃,1500×g离心10min,取上清检测。注:留取20μL样本,用于后续BCA测定。

其余方法:

对于

贴壁细胞

:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。以2百万细胞为例,在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液,震荡混匀细胞,4℃或冰上裂解30min。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理,超声步骤与组织样本相同。

对于

悬浮细胞

:离心收集细胞,以2×10

6

细胞为例,在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液,震荡混匀细胞,4℃或冰上裂解30min。用手指轻弹悬浮细胞以充分裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成(5-10)×10

5

细胞/管,然后再裂解。必要时可以进行超声处理,超声步骤与组织样本相同。注:1×PBS缓冲液使用前,需加入PMSF,现用现加,PMSF终浓度为1mM。打开离心机,将转速调至12000×g;将样本放入离心机,离心10min,取上清,按需要分装,于-20℃贮存。注:留取20μL样本,用于后续BCA法测定样本蛋白含量。



5.细胞培养上清或其他生物体液

收集液体后于2-8℃,1000×g离心20min,除去杂质及细胞碎片。取上清检测。注:因细胞培养基中的胎牛血清影响或其他生物体液中杂蛋白的影响,不建议进行BCA法测定样本蛋白含量。

实验细节与注意事项

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收集血液应避免产生溶血现象。红细胞破碎,释放大量的过氧化物酶,会影响ELISA检测中的辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的酶促反应,造成检测结果的不确定性。

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样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或-80℃(3个月内检测),避免反复冻融。在检测前,冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。

0

3


试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围,建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或过低,请对样本做适当的稀释或浓缩。

04


检测样本的稀释推荐多步稀释法,常规稀释检测为血清/血浆检测稀释度为2倍、20倍、200倍;细胞上清稀释度为5倍、50倍、500倍;建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度。

对于稀释倍数比较大的检测样本,参考稀释方案如下:

稀释100倍:一步稀释。取5μL样本到495μL标准品/样本稀释液内,做100倍稀释;

稀释1000倍:两步稀释。取5μL样本到95μL标准品/样本稀释液内,做20倍稀释,再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内,做50倍稀释,总共稀释1000倍;

稀释100000倍:三步稀释。取5μL样本到195μL标准品/样本稀释液内,做40倍稀释,再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内,做50倍稀释,最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内,做50倍稀释,总共稀释100000倍;

每步稀释时取液量不少于3μL,稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀,避免起泡。


05



若所检样本不在说明书所列样本之中,建议做预实验验证其检测有效性。

06


若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液,由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。

07


某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。

08



对于组织匀浆、组织全蛋白、细胞提取液等蛋白提取样本,经BCA法测定样本蛋白含量后,建议进行蛋白浓度的统一化,避免因组织重量、细胞数、产物体积等因素造成的人为误差;例如,统一全部检测样本浓度为1-2mg/mL,进行后续的稀释和检测。


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